染料法Candidatus Mycoplasma haemaarvum实时定量PCR试剂盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Candidatus Mycoplasma haemaarvum

货号：Mqs-hpa-20      规格：20个反应

货号：Mqs-hpa-50      规格：50个反应

货号：Mqs-hpa-100     规格：100个反应

储存：-20度，避光保存，有效期年。避免反复冻融。

试剂盒特点：

1，    特异性识别Candidatus Mycoplasma haemaarvum，与其他生物基因组无交叉反应。

2，    使用热启动的DNA聚合酶，可抑制非特异性扩增，降低背景荧光。

3，    带有阳性对照样品（组分C），可用于检验试剂盒有效性，以及验证待测样品中是否含有PCR抑制剂。

4，    带有ROX参比染料，帮助校正加样误差和管间差异。

5，    带有UDG酶和dUTP，可降低残留DNA的污染。

目已知寄生于犬血中的支原体有两种： Candidatus Mycoplasma haemaarvum和犬血支原体（Mycoplasma haemocanis ，旧称Haemobartonella canis)。在2004年于只脾切除手术后的犬中次发现Candidatus Mycoplasma haemaarvum，随后发现其在多个地区广泛分布，阳性率在0-33.3%不等。Candidatus Mycoplasma haemaarvum与Candidatus Mycoplasma haemominutum较为相似，直径为0.3微米，无成串相连现象，很少引起明显的溶血，除非是做了脾切除手术或者发生了免疫抑制。

常用的检测方法包括显微镜镜检法和PCR法。镜检法灵敏度低，实验误差大，无法区分支原体种类，易受血液中其他物质以及人工涂片方法的干扰，且支原体易从红细胞表面脱落，造成漏检。而PCR法在灵敏度上则有明显的优势，且可以区分支原体种类。定量PCR法与普通PCR法相比，不仅可以精确定量，而且操作更为方便，更少受环境污染的影响。

本试剂盒针对Candidatus Mycoplasma haemaarvum的16S rRNA基因的保守区域，设计特异性引物，与其他生物基因组没有交叉反应。

本试剂盒包含热启动DNA聚合酶、dNTP（以UTP代替了TTP）、引物、阳性对照品、SYBR Green I染料、ROX染料，和用以防止残余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用户只需准备好DNA样品即可使用。

热启动DNA聚合酶结合了特异性单克隆抗体，在室温下聚合酶活性被抗体抑制。在PCR循环的变性阶段，抗体受热被去除，聚合酶活性恢复，因此获得“热启动”功能，可减少残余DNA的污染，提高PCR扩增效率、灵敏度和目的片段产量。

SYBR Green I可以与DNA双链的小沟结合，结合后在497nm激发光照射下产生520nm的发射光。未结合双链DNA的SYBR Green I基本不产生荧光。因此可以根据荧光值的大小判断溶液内DNA双链的多寡，用于实时检测PCR反应过程中产物的累积量。初始模板浓度越高，反应循环数越高，则双链DNA含量越高，荧光值也就越高。值得注意的是，SYBR Green I也可以结合非特异性PCR产物以及引物二聚体，此时产生的荧光与目标扩增产物无法区分。为了判断荧光信号是否来自目标扩增产物，可以绘制熔解曲线。通过逐步缓慢升温，使双链DNA解离为单链DNA，同时检测荧光值的变化，绘制曲线，根据荧光值观察DNA解链的温度。

UDG和dUTP可以阻止次步骤残余DNA的扩增。dUTP可以确保扩增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可从单链或双链DNA上去除尿嘧啶残基，从而阻止含有尿嘧啶的DNA作为下几轮PCR的模板。在PCR循环开始的UDG孵育步骤，可以破坏带有尿嘧啶的PCR产物。经过该去除污染步骤后，UDG在正常的PCR循环过程中被高温灭活，对PCR反应没有影响。

ROX不参与PCR反应，在PCR反应过程中荧光没有变化，可以提供条基线用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参ROX荧光的比值，使定量更准确。ROX染料的激发波长为584nm，发射波长为612nm。用ROX进行校正后可以使实验误差减小十倍左右。

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