β-榄香烯和 NDV 共修饰对脂质体瘤苗的免疫增强作用
高天慧 段芳龄 刘明月 李晓燕 戚麟

【摘要】 目的  通过脂溶性的抗肿瘤药物 β-榄香烯和新城疫病毒( Newcastle  Disease  Virus，NDV) 对 H22 肝癌细胞可溶性抗原( NDV- H22 抗原) 脂质体瘤苗的共同修饰，来增强瘤苗的抗肝癌效应，为临床抗肝癌的免疫治疗提供实验依据。方法 用 NDV 的弱毒株 losota 株感染 H22 肝癌细胞。用 KCl 法提取可溶性抗原。用改进的机械分散法制备多复层脂质体( MLV) 。将 60 只 BalB / c 鼠腹腔接种 H22 肝癌细胞后随机数字法分为 3 组，每组再分为两部分，24 小时后，分别腹腔接种: 脂质体包裹 NDV 修饰的 H22 抗原( LVAg 组) 、脂质体共包裹 β-榄香烯与 H22 抗原的制剂( LEAg  组) 、脂质体共包裹 NDV-H22 抗原与 β-榄香烯的制剂( LEVAg) 。1 周后进行第二次免疫接种。记录小鼠的生存期，MTT 法测定淋巴细胞毒活性。结果  LEVAg 组的抗肿瘤效应*强，其生存期为( 45. 8 ± 3. 8) d，脾淋巴细胞毒活性为( 46. 4 ± 1. 9) ，
均高于 LVAg 分别为［( 35. 2 ± 5. 5) d 和( 30 ± 2. 8) ］和 LEAg 组分别为［( 37. 8 ± 3. 7) d 和( 29. 0 ± 1. 5) ］ ( P ＜ 0. 001) ; LVAg 和 LEAg 组小鼠的生存期及脾淋巴细胞毒活性无显著性( P ＞ 0. 05) 。结论 将 NDV-
H22 抗原和 β-榄香烯共包入脂质体中，其抗肝癌免疫效应明显增强，二者有协同增效作用。
【关键词】 β-榄香烯; 新城疫病毒; 脂质体瘤苗
肿瘤疫苗作为手术及放疗、化疗的辅助治疗常用来改善宿主的免疫状态，调动机体的免疫反应，杀灭残留在体内的肿瘤细胞。但是由于放疗、化疗的毒副作用及癌症本身，患者的免疫系统往往处于抑制状态，同时肿瘤抗原性弱，肿瘤细胞表达的 MHC-I 类分子减少或缺如，不能有效地将肿瘤抗原提呈给 CD + T 细胞，因此，单纯用肿瘤抗原进行免疫治疗，往往不能诱导有效的抗肿瘤免疫反应。本研究采用新城疫病毒( Newcastle Disease Virus，NDV) losota 株来修饰 H22 肝癌细胞， 并将 NDV 修饰的 H22 肝癌细胞可溶性抗原( NDV-H22 抗原) 与免疫增强剂 β-榄香烯共包于脂质体中，以期得到更进一步的抗瘤效应，为临床抗肝癌治疗提供依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 BalB / c 纯系小鼠，由河南省实验动物中心提供，动物合格证号为 SYXK( 豫) 2005-0012，4-6 周龄，体重 16 ～ 18  g，健康，清洁级饲养，60 只，雌雄各半; 小鼠 H22 肝癌细胞由 BalB / c 小鼠腹腔传代，引自河南省医学科学研究所; 新城疫病毒losota 株由河南农业大学牧医学院微生物教研室卢中华教授惠赠。大豆卵磷脂( PC) ，上海油脂一厂; 胆固醇( CH) ，日本株式会社; 十八烷氨( SA) ，sigma; 牛血清白蛋白，B1B 公司; 新生小牛血清，天津正江技术开发公司;
淋巴细胞分离液，上海劲马生物科技有限公司;   β-榄香烯，大连金港制药有限公司。Beckman 高速低温离心机，Beck-
man 公司; Eppendorf 高速低温离心机 C5417R，Eppendorf 公司; CO2 培养箱，美国 A1SCO; 旋转蒸发仪，上海玻璃仪器二厂; 倒置显微镜，日本 OLYMPUS; 酶联免疫检测仪，第四军医大学。
1.2 方 法
1． 2． 1    新城疫病毒修饰肝癌细胞及可溶性抗原的制备参照文献［1］进行。
1． 2． 2    脂质体的制备及包封率测定 参照我所建立的方法［1-3］略加改进。
1． 2． 3    瘤苗的治疗实验
1． 2． 3． 1    分组  将 60 只 BalB / c 小鼠随机分为为 3 组，每组再分为两部分，一部分用于观察生存期，另一部分用来检测 淋巴细胞对 H22 肝癌细胞的体外杀伤效应。第 1 组为脂质体包裹 NDV 修饰的 H22 抗原组( LVAg 组) ，第 2 组为脂质体共包裹 β-榄香烯和 H22 抗原组( LEAg 组) ，第 3 组为脂质体共包裹 β-榄香烯和 NDV-H22 抗原组( LEVAg 组) 。
1． 2． 3. 2    免疫治疗程序 第 1 天各小鼠腹腔接种 H22 肝癌细胞 1. 1 × 106   个/0. 1  ml，24  h 后腹腔接种各种疫苗 0. 1  ml，每毫升疫苗含 3 × 107 个 H 肝癌细胞所含的抗原，次免疫后一周强化免疫一次。
1. 3 淋巴细胞对 H22 肝癌细胞的体外杀伤试验
1. 3. 1    脾淋巴细胞悬液的制备  第二次免疫后 4  d，将用来检测细胞毒作用的小鼠取出，常规腹部消毒，无菌取脾，D-
Hanks 冲洗，玻璃匀浆器匀浆后过 200 目金属网，淋巴细胞分离液分离、制备淋巴细胞，用培养液调至 5 × 105  个/100 μ1。
1. 3. 2    脾淋巴细胞对 H22 肝癌细胞的体外杀伤试验 参照黄永年［4］等的方法进行。
1. 4    小鼠生存期的观察 每天记录各组小鼠存活数量，从接种之日起，连续观察 50  d，存活 ＞ 50  d 者，认为长期存活。
1.5 统计学方法 用 SPSS 11. 5 软件，应用方差分析 ONE- WAY-ANOVA 对生存期和淋巴细胞毒活性进行统计分析，以P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
2结果
2.1 KCl 法提取的可溶性抗原的蛋白含量 每 106 个 H 肝癌细胞所抽提的蛋白为 107μg，每 106   个 NDV 修饰后 H肝癌细胞所抽提的蛋白为 119 μg。
2. 2 脂质体的包封率 脂质体对 LVAg、LEAg、LEVAg 的包封率分别 39. 45% ，44. 38% 和 39. 45% ，对 β-榄香烯的包封率为 81. 36% 。
2. 3 不同免疫治疗的效应观察
2. 3. 1 不同的免疫治疗对 BalB / c 小鼠生存期的影响  对荷瘤小鼠分别用不同的疫苗制剂间隔 1 周进行连续两次的免疫后，LVAg 组、LEAg 组和 LEVAg 组的平均生存期分别为 ( 35. 2 ± 5. 5) d、( 37. 8 ± 3. 7) d 和( 45. 8 ± 3. 8) d，3 组间差异有显著性( F = 15. 823，P ＜ 0. 001) ，其中，LEVAg 组的平均生存期长于 LVAg 组( P ＜ 0. 001) 和 LEAg 组( P ＜ 0. 001) ，而后二者之间差异无显著性( P = 0. 197) 。
2. 3. 2 不同免疫治疗组小鼠脾淋巴细胞体外杀伤 H22 肝癌细胞活性观察 在效靶比为 50: 1  时，LVAg 组、LEAg 组和
LEVAg 组的脾淋巴细胞毒活性分别为: ( 30. 0 ± 2. 8) 、( 29. 0
± 1. 5) 和( 46. 4 ± 1. 9) ，3 组间差异有显著性( F = 210. 105，P
＜ 0. 001) ，其中，LEVAg 组的脾淋巴细胞毒活性强于 LVAg
组( P ＜ 0. 001) 和 LEAg 组( P ＜ 0. 001) ，而后二者之间差异无显著性( P = 0. 322) 。
3讨论
脂质体包裹可增加抗原的颗粒性，较可溶性抗原更易被 抗原提呈细胞吞噬和提呈［5］。巨噬细胞对脂质体具有优先 摄取，脂质体包裹的抗原可经巨噬细胞的 MHC-Ⅰ途径激活CD + T 细胞，发挥主要的抗瘤作用，同时又可经 MHC-Ⅱ途径激活 CD +  T 细胞，CD +  T 细胞( 包括 Th 细胞)  被激活后释放细胞因子，一方面促进激活的 CD + T 细胞的细胞毒活性，另一方面促进 B 细胞产生体液免疫，促进机体的抗瘤免疫作用。
病毒用于抗肿瘤免疫治疗*初源于“病毒异种化作用” 的概念，即通过使肿瘤细胞表面带有外来病毒相关抗原，增强其免疫原性，易于为宿主的免疫系统识别。NDV 是禽类的一种副粘液病毒，对癌细胞具有较强的亲和力，可在癌细胞内大量复制，而对正常细胞影响不大［6］。体外实验中，NDV致敏可显著增加DC-CIK 对于胃癌细胞株的杀伤力［7］。在临床研究中，NDV 修饰的自体肿瘤细胞疫苗能改善晚期结肠癌患者的生存［8］。
榄香烯为脂溶性的非细胞毒性的广谱抗肿瘤药物，同时又具有免疫增强作用。榄香烯能改变或增强肿瘤抗原的免疫原性，诱发或促进机体对肿瘤的免疫排斥作用［9］。此外， 榄香烯能显著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数，增强 CONA 诱导的小鼠脾细胞的增殖，增加 NK 细胞的活性［10］。
本研究用 NDV 修饰脂质体瘤苗，以增强肿瘤抗原的免疫原性，更易为宿主识别，同时用免疫增强剂榄香烯来刺激 机体免疫反应，获得了*强的抗瘤免疫效应，显著高于单用
NDV  修饰脂质体瘤苗和单用榄香烯修饰脂质体瘤苗，提示二者的协同增效作用。免疫效应的增强可能源于榄香烯的免疫增强作用，NDV 的抗原异源化作用，以及脂质体包裹后的抗原提呈的作用的加强。共包裹榄香烯和 NDV 修饰的脂质体肝癌瘤苗有潜在的临床应用价值，为抗肝癌治疗提供有效 的补充手段，值得临床进一步研究。
参考文献
［1］ 高天慧，段芳龄，刘明月． NDV 修饰对 H22 肝癌细胞脂质体瘤苗免疫作用影响的观察．  中华肿瘤防治杂志，2011，18 (  3 ) : 180-182．
［2］ 高天慧，段芳龄，高海玲，等． 脂质体瘤苗抗小鼠 H22 腹水型肝癌作用研究． 胃肠病学和肝病学杂志，2005，14( 4) : 366-368．
［3］   高天慧，段芳龄，周云，等． β-榄香烯对脂质体瘤苗抗小鼠 H22肝癌的免疫增强作用． 中国误诊学杂志，2005，12 ( 5 ) : 3409-3411．
［4］ 黄永年，李薇． 噻唑兰比色法实验条件的研究． 中华医学检验杂志，1992，15( 4) : 229-230．
［5］   Ying M，Reginr，Claudio T，et al． MHC class I-and class Ⅱ-restrict- ed processingand  presentation  of  microencapsulated  antigens． Vac- cine，1999，17: 1047-1056．
［6］   Ravindra PV，Tiwari AK，Sharma B，et al． Newcastle disease virus as an oncolytic agent．  Indian J Med Res，2009，130( 5) : 507-13.
［7］ 李辉，王震，毛伟征，等． 新城疫病毒对胃癌细胞抗原修饰作用的研究． 齐鲁医学杂志，2009，24( 4) : 306-308．
［8］   Schulze T，Kemmner W，Weitz J，et  al．  Efficiency  of  adjuvant  ac- tive specific immunization with Newcastle disease virus modified tumor cells in colorectal cancer patients following resection of liver metastases:  results  of  a  prospective  randomized  trial．   Cancer  Im- munol Immunother，2009，58( 1) : 61-69．
［9］   吴伟忠，刘廉达，汤晓雷，等．  β-榄香烯诱导的抗肿瘤免疫保护作用机理初探． 中华肿瘤杂志，1999，21( 6) : 405-406．
［10］   陈龙邦，臧静，王靖华．   β-榄香烯对荷瘤小鼠免疫功能的影响． 肿瘤防治研究，1998，25( 1) : 54．
=========了解更多，请下载文献或者前来咨询我公司业务员哦，更多产品文献等着您！