标题不用酶切，PCR 也可以帮你完成分子克隆

限制性内切酶脾气很大，遇到「不开心的事儿」她就会罢工。同样地，当限制性内切酶遇到了甲基化的质粒，她也就这样悄无声息地罢工了，留下实验失败的你独自流泪。

甲基化是细菌用来保护自己的基因序列不被自身合成的限制性内切酶所切割，是细菌的一种自我保护机制。常见的甲基化包括了 Dam+、Dcm+、EcoKI+、EcoBI+ 以及真核细胞中的 CpG 等。同理，不同的甲基化也能够识别特定的序列，从而在特定的碱基上进行。如果当限制性内切酶所识别的序列与甲基化识别的序列相同或者重叠时，限制性内切酶将不能够切开该位点序列（见表二）。另外，还需注意一点，我们实验所采用的大肠杆菌是否是属于上述甲基化的阳性菌株，如果是，恭喜你，实验失败很正常，懵逼树下的懵逼果等你去尝尝。所以，快去看看你所用的限制性内切酶是否和甲基化的识别序列重合，你的克隆菌株是否是甲基化的阳性菌株吧。

不用酶切，PCR 也可以帮你完成分子克隆：

1、反式 PCR

我们都知道，在做分子克隆的时候，必须要用限制性内切酶将环状质粒切割成为线性，才能够连接我们的目的片段。那么，大家有没有想过，在我们的酶切位点两头，以质粒为模板设计引物，反向直接扩增我们的质粒呢？这样的质粒天生就是线性化的质粒，而且无需进行摇菌培养质粒提取和酶切等复杂的操作。这就是我们所说的反式 PCR。是不是很简单？对，就是这么简单到你怀疑人生。但有一个问题来了，整个反应体系中的模板即我们原来的环状质粒，如果在进行克隆连接的时候岂不是也被导入到宿主细胞中表达，也就是说我们挑菌的时候也是有概率会挑到这些空载载体的！如何解决？接着看就明白了。

2、DpnI 切割反式 PCR 中的环状质粒

之前小编在甲基化中提到过，我们还有一个特殊的限制性内切酶没有提到，它就是 DpnI。这个酶之所以特殊，其原因在于它不同于其他的限制性内切酶，它只有当存在 GATC 序列被甲基化的时候才能够发挥它的活性，进行完全的切割，也就是说它和其他受到甲基化影响的酶是相反的。甲基化只有在甲基化阳性的原核或者真核生物中才能够存在。所以，当我们用 Dam+菌株提取的质粒进行反式 PCR 的时候，为了降低后期克隆实验的空载率，我们需要使用 DpnI 来消化我们原来用于模板扩增的环状质粒，由于质粒上存在多个 GATC 甲基化的序列，因此，DpnI 能够将原来环状质粒直接切割成多条片段，另外，PCR 扩增的线性质粒并没有在原核生物体内进行过甲基化，因此线性质粒的序列不会被 DpnI 识别切割，从而达到我们分离环状质粒和线性质粒的需求。这里需要提醒下小伙伴们，如果你们的质粒模板是从 Dam-菌株里面提取的，那么以上的方法就不再适用了！至于原因，大家可以想一想，小编就不在这里赘述了。

关于限制性内切酶，目前已经商业化的品种已经两百多种，作为目前世界排名靠前的内切酶生产商，莫纳生物对这类基础工具酶已经研究探索多年，为了打破国外四十多年的垄断地位，绕过国际专利保护，莫纳生物自主研发了全新的内切酶生产工艺，目前在售的快速内切酶已经四十多种（持续增长中），现阶段已经基本满足常规的生物学实验需求。

都 9102 年了，你还在用传统的方法做克隆？

克隆虐我千百遍，我待克隆如初恋。做个克隆，至少需要两天的时间，还要忙前忙后准备一大堆需要的东西。麻不麻烦，累不累啊！有这个时间，我多看两篇文献，多编两行 Python 代码不好吗？小编说过，越基础的实验越是需要牢固掌握，但同样越是基础的实验越是需要我们节省时间，提高效率。