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质粒提取步骤

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资料简介

一、实验原理:
        碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0 ~12.5 这个狭窄的范围内,线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH 4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时,共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA ,蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
 
二、操作步骤:
        1. 准备20ml灭菌过的培养管,编号,分别加入8ml LB培养基,再加入8µl 相应抗生素,可适量多加;
        2. 用10µl 白色枪头挑取挑取单个菌落至培养管中,37℃震荡过夜(274rpm);
        3. 取2ml过夜培养的菌液加入离心管中,室温10000rpm离心2min,去上清;(可重复步骤2,直至菌液离心完)(去上清时用纸吸一下)
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