膜蛋白提取试剂盒Membrane Protein Extraction Kit
产品编号：SH0580
包装规格：50 Assays
产品简介
本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白。特殊的提取Buffer 在裂解细胞的同时，经过特殊处理，还可以选择性地分离提取细胞膜蛋白和胞器质膜蛋白。提取方法简单，可靠，快速。获得的膜蛋白纯度高，可用于SDS-PAGE、Western Blot 、免疫共沉淀或细胞信号传导等后续研究，每次可以提取107个培养细胞或200 mg动物组织，本试剂盒可以使用50次。
膜蛋白提取试剂盒Membrane Protein Extraction Kit产品特点
1.整个操作过程只需要60 min左右。
2.即可以用于培养细胞（50x107 个），有可以用于动物组织（50 x 200 mg）蛋白质的提取。
3.避免蛋白酶对蛋白质的降解，保持膜蛋白质的完整性和天然活性。
4.提取的膜蛋白纯度高，不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。
运输和保存条件
在常温下运输，收到后，将蛋白酶抑制剂、Loading Buffer 、DTT 于在-20°C的环境中保存，其余4°C保存，保质期一年。
产品组成
成分
洗涤液10×50 mL
提取Buffer50 mL
蛋白酶抑制剂50 μL
Loading Buffer1 mL
DTT50 μL
操作步骤
1.对于悬浮培养或用细胞刮子刮下的贴壁培养的细胞，离心收集不少于1×107细胞，再用预冷的双蒸水稀释的一倍浓度的洗涤液洗涤细胞三次，每次3000 rpm（800 g）离心5 min。
2.组织样本（200 mg）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，冰上剪碎，再用预冷的一倍浓度的洗涤液洗涤细胞三次。
3.在上述细胞或组织样本中加入1 mL提取Buffer（使用前，每mL提取Buffer 加入1 μL蛋白酶抑制剂和1 μL DTT），4 C下玻璃匀浆器上下手动匀浆30~50次。或超声破碎细胞，每次30 sec，3~4次，每次间隔1 min，置于冰上冷却。均质匀浆或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％，同时没有明显的组织小块。
ü因提取Buffer 在室温时会分层，请务必在冰上放置30 min后，混匀，立即加入。
4.装入1.5 mL的预冷的离心管中，冰上放置10 min左右，期间取出剧烈震荡2~3次，于4°C，14000 rpm（17500 g）离心 10 min，弃沉淀，上清转至新管中。
5.上清置于37°C水浴10 min。再室温，13000 rpm 离心5 min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）。
ü建议使用进口透明性较好的微量离心管，可见下层为含膜蛋白的有机相。上下两层因均为透明，只在交界处有一折光线，
需仔细观察才可见到。或室温静置30 min~60min 亦可见分层分上下两层，水平转头在高速旋转的时候容易使有机相和水相保持分层状态，以下亦同。
6.取下层，加入500 μL冰冷灭菌水，4°C放置5 min，再置于37°C 水浴10min。
7.室温，13000 rpm（15000 g）离心5 min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）。
8.取下层，加入500 μL 冰冷灭菌水，4°C放置5 min，再置于37°C 水浴10 min。
9.室温，13000 rpm（15000 g）离心5 min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）。
10.最终得到的下层即为膜蛋白提取物，冷冻保存。
附SDS-PAGE电泳前样品准备
1.每100μL 膜蛋白提取混合物加入0.9 mL 丙酮，冰浴20 min，12000 rpm（12830g）离心20 min。
2.弃上清，沉淀真空旋干或置冰上干燥约10 min到30 min（敞开离心管盖）。
3.该步可选。可以加入Urea、Thiourea、NDSB-201 等强溶解能力试剂溶解膜蛋白。分装，冷冻保存。
4.加入适当体积的Loading Buffer（使用前每100 μL Loading Buffer 加入2~5 μL巯基乙醇）溶解，彻底分散（枪头反复吹吸或剧烈涡旋），煮沸5 min，离心取上清。
膜蛋白提取试剂盒Membrane Protein Extraction Kit
注意事项
1.所有的试剂及器具均需预冷后使用，以保证蛋白质的完整性。细胞或组织量需达到要求。
2.抽提Buffer 4°C时，为混悬状态，请于此温度下混匀后吸取加入样本中。
3.室温25°C~37°C时，抽提Buffer需静置30min以上可看到分为上下两层，其中约9/10 至4/5 为上层水相，下层只占1/10 至 1/5 为有机相。
4.加入Urea、Thiourea、NDSB-201 等强溶解能力试剂的Loading Buffer 有助于膜蛋白的完全溶解。
5.如果需要，请在实验前，在提取Buffer中加入1倍浓度的磷酸酶抑制试剂，再进行动物组织或细胞膜蛋白质的提取。
6.对提取的膜蛋白质，可以采用我公司生产的非干扰型蛋白质浓度定量试剂盒或改良型Lowry 法蛋白质浓度定量试剂盒或改良型BCA 法蛋白质浓度定量试剂盒对提取样品中的蛋白质进行定量。
7.提取的膜蛋白质，如果用于2D 电泳，可以将操作步骤10 所得的膜蛋白沉淀，使用我公司生产的膜蛋白质溶解液或2D 样品提取液进行溶解，再用于2D 电泳。
8.如果用于蛋白质质谱研究，请用请用我公司生产的铜染或锌染或质谱用快速银染试剂盒对胶上的蛋白质进行染色，这些染色方法对蛋白质没有修饰作用，所以对质谱图没有影响。对于一般的染色，可以采用无毒型考马氏亮蓝染色液或高灵敏考马氏亮蓝染色液进行染色。
9.使用后请旋紧瓶盖，防止溶液挥发和与空气的物质发生化学反应。
10.本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果，概不承担责任。
