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标题手把手教你细胞凋亡检测实验的方法

   

提供者:上海沪鼎生物科技有限公司    发布时间:2020/7/30   阅读次数:37次 >>进入该公司展台
一、PI 单染色法
1. 收集细胞{数目约(1~ 5)×106 个/mL},500 ~ 1000 r/min 离心 5min,弃去培养液。
2. 3ml PBS 洗涤 1 次。
3. 离心去 PBS,加入冰预冷的 70%的乙醇固定,4℃,1—2 小时。
4. 离心弃去固定液,3mlPBS 重悬 5min。
5. 400 目的筛网过滤 1 次,500—1000r/min 离心 5min,弃去 PBS。
6. 用 1ml PI 染液染色,4℃避光 30min。
7. 流式细胞仪检测:PI 用氩离子激发荧光,激光光波波长为 488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光分析 PI 荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。
8. 结果判断:在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上,凋亡细胞与正常细胞相比,前散射光降低,而侧散射光可高可低,与细胞的类型有关;在分析 PI 荧光的直方图时,先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片,在 PI 荧光的直方图上,凋亡细胞在G1/G0 期前出现一亚二倍体峰。如以 G1/G0 期所在位置的荧光强度为 1.0,则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为 0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的 PI 荧光强度做参照标准,两者分别为 0.35 和 0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。

注意事项:
细胞凋亡时,其 DNA 可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种 DNA 可染性降低也可能是因为 DNA 含量的降低,或者是因为 DNA 结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

二、Annexin V/PI 双染色法

1. 细胞收集:悬浮细胞直接收集到 10ml 的离心管中,每样本细胞数为(1~5)×106,/mL 500~1000r/min 离心 5min,弃去培养液。
2. 用孵育缓冲液洗涤 1 次,500~1000r/min 离心 5min。
3. 用 100ul 的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育 10~15min。
4. 500~1000r/min 离心 5min 沉淀细胞孵育缓冲液洗 1 次。
5. 加入荧光(SA-FLOUS)溶液 4℃下孵育 20min,避光并不时振动。
6. 流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用 488nm,用一波长为 515nm 的通带滤器检测 FITC 荧光,另一波长大于 560nm 的滤器检测 PI。
7. 结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如 PI 有抗染性,坏死细胞则不能。

总结:细胞膜有损伤的细胞的 DNA 可被 PI 着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期 PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI- )

三、Heochst 33342/PI 双染色法

1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入 Heochst 33342 ,终浓度为 1ug/ml; 37℃孵育7—10min。
2. 低温 500 ~ 1000r/min 离心 5min 弃去染液。
3. 加入 1.0ml PI 染液,4℃避光染色 15min。
4. 400 目的筛网过滤 1 次。
5. 流式细胞仪分析:Heochst 33342 用氪激光激发的紫外线荧光,激发光波波长为352nm,发射光波波长为 400 ~ 500nm,产生兰色荧光;PI 用氩离子激光激发荧光,激发光波波长为 488nm,发射光波波长大于 630nm,产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。
6. 结果判断:在兰色荧光对红色荧光的散点图上,结果为:正常细胞为低蓝光/低红光,凋亡细胞为高蓝光/低红光,坏死细胞为低蓝光/高红光。

注意事项:
① 在红色荧光对兰色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的 DNA 进一步降解的缘故。
② 用 Heochst 33342 染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在 20min 之内为宜。如果太长可引起 Heochst 33342 的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与兰色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。


关键词:手把手教你细胞凋亡检测实验的方法  

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